Charakterisierung der funktionalen Rolle von Cytohesin-1 in der LFA-1-vermittelten T-Zell-Adhäsion

Episode von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 von Ludwig-Maximilians-Universität München · 1. Februar 2001

Das Leukocyten-spezifische Integrin LFA-1 spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort,

durch die Vermittlung dynamischer Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen. Die kontrollierte

Adhäsion bzw. Deadhäsion von Leukocyten bedarf einer spezifischen Regulation des

LFA-1-Integrins und die Aufklärung der molekularen Grundlagen dieser Vorgänge ist von

großem Interesse.

Cytohesin-1 war unmittelbar vor Beginn dieser Arbeit als cytoplasmatischer Regulationsfaktor

der durch LFA-1 vermittelten Zelladhäsion identifiziert worden und seine spezifische Interaktion

mit der cytoplasmatischen Domäne von CD18 konnte in vitro dokumentiert werden.

Im Rahmen dieser Arbeit gelang es zunächst, die Assoziation von Cytohesin-1 und LFA-1

auch endogen, im intakten Zellverband, mittels Kolokalisationsstudien in der lymphoblastoiden

B-Zellinie LCL-721, zu demonstrieren. Ferner konnte mit Hilfe von Mutationsanalysen

die, für die Interaktion kritische Region in der cytoplasmatischen Domäne von CD18 lokalisiert

werden. Sie befindet sich im aminoterminalen Bereich und umfaßt die Aminosäuren

WKA(723 - 725). Die Mutation dieser Aminosäurereste nach TRG resultierte in einem vollständigen

Interaktionsverlust mit Cytohesin-1. Die Inhibition der Cytohesin-1/CD18-Bindung

konnte dabei sowohl durch Protein-Protein-Interaktionsanalysen in Hefe als auch durch biochemische

Bindungsstudien in vitro dokumentiert werden, wobei jeweils Fusionsproteine der

cytoplasmatischen Domäne von CD18 charakterisiert wurden.

Funktionale Analysen der WKA(723-725)-Region von CD18 ergaben, daß die Mutation von

WKA(723-725) nach TRG im intakten LFA-1-Molekül eine signifikante Reduktion der Integrin-

Aktivität zur Folge hatte. Sowohl T-Zellklone als auch nicht hämatopoetische Zellen,

wie HeLa, wiesen nach Expression von LFA-1(TRG), mit Hilfe rekombinanter Vaccinia-

Viren, eine stark reduzierte Adhäsionsfähigkeit an immobilisiertes ICAM-1 auf. Ferner ergaben

funktionale Studien mit HeLa-Zellen, die LFA-1 stabil exprimierten, daß Cytohesin-1 nur

dann eine gesteigerte Adhäsion dieser Zellen an ICAM-1 induzierte, wenn sie Wildtyp-LFA-1

exprimierten. HeLa-Zellen, die LFA-1(TRG) exprimierten, ließen sich durch Cytohesin-1 zu

keiner verstärkten Adhäsion aktivieren.

Diese Ergebnisse demonstrierten die Bedeutsamkeit der Cytohesin-1/CD18-Interaktion für

eine effiziente, durch LFA-1 vermittelte Zelladhäsion. Unklar war jedoch der Mechanismus,

durch den Cytohesin-1 die Integrin/Liganden-Bindung regulierte. Studien mit dem Reporterantikörper

24 ließen darauf schließen, daß Cytohesin-1 durch die Bindung an CD18 eine Konformationsänderung in der extrazellulären Domäne des LFA-1-Integrins induzieren

konnte, die möglicherweise die Affinität des Rezeptors modulierte. Diese Modulation der

LFA-1-Konformation schien jedoch nicht hinreichend für eine stabile Bindung an ICAM-1 zu

sein, wie eingehendere Analysen von Dr. W. Kolanus zeigten. Vielmehr erforderte eine effiziente

Zelladhäsion zusätzlich die Guaninnukleotid-Austauschfunktion (GEF-Funktion) von

Cytohesin-1, da die GEF-defekte Punktmutante, Cytohesin-1(E157K), nicht mehr in der Lage

war, die Adhäsion von Jurkat E6-Zellen an ICAM-1 stabil zu induzieren. Biochemische Interaktionsstudien

konnten dabei zeigen, daß die Mutante weiterhin fähig war, die cytoplasmatische

Domäne von CD18 zu binden.

Diese und weitere Ergebnisse von Dr. W. Nagel, die einen Zusammenhang zwischen der

GEF-Funktion von Cytohesin-1 und dem „Spreading“ von adhärenten Jurkat E6-Zellen aufzeigten,

legen die Vermutung nahe, daß Cytohesin-1 durch einen dualen Mechanismus in die

LFA-1-Regulation involviert ist. Sowohl die direkte Interaktion von Cytohesin-1 und dem

Integrin als auch seine GEF-Funktion stellen essentielle Faktoren für eine stabile Zelladhäsion,

die durch LFA-1 vermittelt wird, dar. Welche funktionalen Mechanismen dabei durch den

Guaninnukleotid-Austausch und der damit verbundenen Aktivierung einer GTPase induziert

werden, ist noch unklar. Primär wäre eine Modulation des Aktin-Cytoskelettes und eine damit

verbundene erhöhte laterale Mobilität der Integrine denkbar, die eine verstärkte Rezeptormultimerisierung

und dadurch eine Aviditätsänderung des Integrins ermöglicht.

Weitere Studien dieser Arbeit analysierten die Regulation von Cytohesin-1 selbst. Es konnte

gezeigt werden, daß PI3-Kinase in die Kontrolle der Cytohesin-1-Funktion involviert war.

Die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form dieser Kinase (P110*) führte zu einer gesteigerten

Adhäsion von Jurkat E6-Zellen an ICAM-1. Eine Inkubation dieser Zellen mit dem

PI3-Kinase-spezifischen Inhibitor Wortmannin resultierte dagegen in einer signifikanten Reduktion

der Zelladhäsion.

Weitere funktionale Analysen, die die Zelladhäsion von Jurkat E6-Zellen nach Koexpression

von P110* und der PH-Domäne von Cytohesin-1 untersuchten, sowie eingehendere Studien

von Dr. W. Nagel, ermöglichten die Entwicklung eines Modells zur Regulation von Cytohesin-

1. Demzufolge führt die Aktivierung der PI3-Kinase zu einer verstärkten Rekrutierung

von Cytohesin-1 an die Plasmamembran. Als Rekrutierungsmodul fungiert dabei die PHDomäne,

die durch Bindung von PtdIns(3,4,5)P3, einem Produkt der PI3-Kinase, die Assoziation

mit der Membran gewährleistet. Die Rekrutierung von Cytohesin-1 an die Plasmamembran führt zur Aktivierung von LFA-1 und der damit verbundenen stabilen Zelladhäsion an ICAM-1.

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