Qualitätskontrolle von Proteinen in Mitochondrien

Episode von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 von Ludwig-Maximilians-Universität München · 19. Juni 2001

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte der

Qualitätskontrolle von Proteinen in Mitochondrien untersucht. Die

Themengebiete umfaßten die Identifizierung und Charakterisierung neuer

mitochondrialer Chaperonine und AAA-Proteasen sowie Struktur-

Funktionsanalysen an der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae.

(1) Tcm62 aus S. cerevisiae weist eine geringe, aber signifikante

Sequenzähnlichkeit zu Chaperoninen der Klasse I (z. B. GroEL aus E. coli

oder Hsp60 aus Mitochondrien von S. cerevisiae) auf. Die im Rahmen der

vorliegenden Arbeit durchgeführten funktionellen Untersuchungen

belegen, daß Tcm62 ein neues, in der mitochondrialen Matrix lokalisiertes

molekulares Chaperon darstellt. Wie andere Chaperonine bildet es einen

hochmolekularen Komplex von ~850 kDa. Tcm62 übt unter Hitzestreß

essentielle Funktionen in der Zelle aus. Der Verlust von TCM62 führt bei

erhöhten Temperaturen zu einer Wachstumshemmung der Zellen auf nichtfermentierbaren

Kohlenstoffquellen. Unter diesen Bedingungen ist Tcm62

essentiell für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Proteinsynthese

und damit für die Synthese mitochondrial kodierter Untereinheiten der

Atmungskettenkomplexe. In Übereinstimmung mit einer Chaperonaktivität

von Tcm62 wird das Protein darüber hinaus für die Unterdrückung der

Aggregation des ribosomalen Proteins Var1 bei erhöhten Temperaturen

benötigt.

(2) Es wurden zwei neue Vertreter der Familie der AAA-Proteasen,

MAP-1 (für matrix-AAA-protease; auch m-AAA-Protease) und IAP-1 (für

intermembranespace AAA-protease; auch i-AAA) im Fadenpilz N. crassa

identifiziert und charakterisiert. Die entsprechenden Gene wurden unter

Verwendung von DNA-Sequenzfragmenten, die aufgrund einer ESTDatenbank

bekannt waren bzw. durch experimentelles Absuchen des

Genoms von N. crassa mit Hilfe der PCR-Technik und degenerierter Primer erhalten. AAA-Proteasen wurden bislang in S. cerevisiae

funktionell charakterisiert. Die Identifizierung neuer Vertreter dieser

Proteasenfamilie in N. crassa ermöglichte erstmalig einen Vergleich der

Funktionen in unterschiedlichen Organismen. Dabei ergaben sich

konservierte Eigenschaften, jedoch auch funktionelle Unterschiede

zwischen den orthologen Proteinen.

Biochemische Analysen zeigten, daß AAA-Proteasen aus N. crassa,

ebenso wie diejenigen aus S. cerevisiae, hochmolekulare Komplexe mit

ähnlichen Molekulargewichten in der mitochondrialen Innenmembran

bilden. Von besonderer Bedeutung ist die Konservierung der

Membrantopologie mitochondrialer AAA-Proteasen, die in beiden

Organismen ihre katalytischen Domänen auf gegenüberliegenden Seiten

der Membran exponieren. Untersuchungen an Modellproteinen weisen

darauf hin, daß eine effiziente Qualitätskontrolle von Innenmembranproteinen

die Anwesenheit von AAA-Proteasen auf beiden Membranseiten

erfordert.

Eine Phänotypanalyse eines N. crassa-Stamms, indem das iap-1-Gen

disruptiert wurde, ergab Hinweise auf funktionelle Unterschiede zwischen

i-AAA-Proteasen aus S. cerevisiae (Yme1) und N. crassa (IAP-1). In

beiden Organismen führt zwar die Abwesenheit der i-AAA-Protease zu

einer Hemmung des Zellwachstums auf nicht fermentierbaren

Kohlenstoffen unter Hitzestreß. Ein kältesensitives Wachstum oder eine

Veränderung der mitochondrialen Morphologie, wie sie für die Disruption

der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae beschrieben ist, wurde allerdings in

iap-1-defizienten N. crassa-Hyphen nicht beobachtet. Die in S. cerevisiae

durchgeführten Komplementationsversuche belegen überlappende, jedoch

nicht identische Funktionen der i-AAA-Proteasen in beiden Organismen.

Durch die Expression von IAP-1 in S. cerevisiae-Zellen mit deletierten

YME1-Gen, wurden lediglich das reduzierte Wachstum dieses Stamms bei

15°C und, zumindest teilweise, der Morphologiedefekte der Mitochondrien

unterdrückt. IAP-1 konnte jedoch nicht wichtige Funktionen von Yme1 bei 37°C übernehmen. Dennoch kann aufgrund dieser Befunde IAP-1 als das

Ortholog der AAA-Protease Yme1 bezeichnet werden.

(3) Um einen weiteren Einblick in den Funktionsmechanismus der AAAProteasen

zu erlangen, wurde die Oligomerisierung der i-AAA-Protease

aus S. cerevisiae näher untersucht. Dabei zeigten am isolierten

Proteasekomplex durchgeführte Studien eine essentielle Funktion der

Oligomerisierung für die ATPase-Aktivität der AAA-Protease. Darüber

hinaus wurde mit Hilfe von Deletionsanalysen die aminoterminale, in der

Matrix lokalisierte Region von Yme1 als eine für die Assemblierung

wichtige Domäne identifiziert. Der Verlust dieser nur gering konservierten

Domäne bedingt eine teilweisen Inaktivierung der i-AAA-Protease in vivo.

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