Herstellung von Epstein-Barr Virus Glykoproteinmutanten zur Veränderung des Wirtsspektrums

Episode von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 von Ludwig-Maximilians-Universität München · 25. Juni 2001

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus

von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch

Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung

bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte

Pseudotypisierung zu erreichen.

Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen

Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt.

Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu

früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion

von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom

Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war

jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn

auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse

weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen

sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der

durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen

Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die

Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante

bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV

essentiell ist.

Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der

gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen

ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem

gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen

zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die

Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und

CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der

Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen

zuzutreffen.

Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen

zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des

gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den

Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf

aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor

konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von

EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in

der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive,

hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen

Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten,

daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit

dem c-kit Rezeptor erfolgt.

Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV

Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus"

zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an

die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.

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