Neuropeptid Y- und Prionprotein- spezifische Aptamere

Episode von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 von Ludwig-Maximilians-Universität München · 20. Juni 2001

Die LQYLWUR Selektion ermöglicht es aus kombinatorischen Nukleinsäurebibliotheken

Oligonukleotidsequenzen zu identifizieren, die verschiedenste Zielmoleküle mit hoher

Affinität und Spezifität binden können. Dadurch haben sich Aptamere zu einer

potenten Alternative zu den in der Diagnose, Therapie und als Forschungsreagentien

etablierten Antikörper entwickelt.

Mit Hilfe der SELEX-Technologie (6ystematic (volution of /igands by (;ponential

Enrichment) ist es in dieser Arbeit gelungen, 2' amino-stabilisierte RNA-Aptamere

gegen das Neuropeptid Y und ein ausgewähltes, funktionell relevantes

Prionproteinepitop zu generieren. Die Anreicherung funktioneller Sequenzen erfolgte

durch einen affinitätschromatographischen Prozess. Zudem sollten bereits

vorliegende RNA-Aptamere, die gegen das rekombinante Prionprotein in früheren

Arbeiten selektiert wurden, charakterisiert werden.

Das Neuropeptid Y (NPY), bestehend aus 36 Aminosäuren, gehört zur Familie der

pankreatischen Polypeptide und ist bei der Steuerung einer Vielzahl physiologischer

und pathophysiologischer Prozesse von Bedeutung. Es wird angenommen, daß

durch selektive Bindung unterschiedlicher NPY-Konformationen an die einzelnen GProtein

gekoppelten NPY-Rezeptorsubtypen (Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 und Y6)

unterschiedliche Signale vermittelt werden können. Dieses differentielle

Bindungsverhalten von NPY an seine Rezeptorsubtypen ist bisher unvollständig

verstanden.

Die in dieser Arbeit generierten Anti-NPY-Aptamere binden ihr Zielmolekül -NPY- mit

einer Affinität von 370 nM und sind durch eine hohe Spezifität innerhalb der

pankreatischen Polypeptidfamilie charakterisiert. Die Bindungsregion des Aptamers

an den C-Terminus des Neuropeptid Y wurde durch Kartierungs-Experimente mit

NPY-Analoga LQ YLWUR bestimmt. Die NPY-Analoga stellen sowohl verschiedene

Untereinheiten von NPY, als auch Modifikationen des Peptides, die zu

Rezeptorsubtypspezifitäten führen, dar. Durch Punktmutationen im C-terminalem

NPY-Bereich konnte u.a. gezeigt werden, daß die Aminosäure Arginin an Position 33 für die Komplexbildung von NPY und Aptamer essentiell ist. In den Bindungsstudien

in Gegenwart selektiver Agonisten zeigte sich, daß die Bindungseigenschaften von

NPY am Y2 Rezeptor weitgehend mit denen an das Aptamer übereinstimmen. Die

Kompetition des Aptamers mit den Rezeptoren um 3H-NPY wurde an Zellen, die die

Rezeptoren NPY-Y1, NPY-Y2, bzw. NPY-Y5 exprimieren, untersucht. Das Aptamer

verdrängte NPY mit besonders hoher Affinität am Y2 Rezeptor im Vergleich zur

Verdrängung am Y1- bzw. Y5-Rezeptor.

Die Anti-NPY-Aptamere weisen ein Bindungsverhalten am NPY vergleichbar zum

Y2-Rezeptor auf und stellen damit ein wertvolles Werkzeug zur selektiven

Charakterisierung der Interaktion zwischen NPY und seinen Rezeptoren dar.

Von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese der übertragbaren

spongiformen Enzephalopathien ist die infektiöse Form des Prionproteins (PrPSc). Es

wird angenommen, daß PrPC durch einen posttranslationalen Prozeß in PrPSc

konvertiert werden kann. Trotz identischer Primärstruktur unterscheiden sich die

beiden Prionproteinisoformen (PrPC und PrPSc) grundlegend in ihren biochemischen

und biophysikalischen Eigenschaften.

Die in früheren Arbeiten selektierten Prionprotein-Aptamere sollten im Hinblick auf ihr

diagnostisches Potential charakterisiert werden. Erste strukturelle Untersuchungen

führten zu der Annahme, daß die RNA-Aptamere ein G-Quartett als stabilisierendes

Sekundärstrukturmotiv ausbilden können. Sowohl Kartierungsstudien mit

unterschiedlichen Prionproteinpetiden als auch Bindungsstudien mit N-terminal

trunkiertem PrPSc zeigten, daß der N-Terminus für die Bindung der Aptamere

essentiell ist. In Gelshiftexperimenten mit verschiedenen Hirnhomogenaten konnte

die spezifische Bindung der Aptamere an authentisches PrP gezeigt werden.

Aufgrund der fehlenden PrPSc-Isoformspezifität der untersuchten Aptamere ist eine

diagnostische Anwendung kaum denkbar. Die Bindung der Aptamere in der pKsensitiven,

N-terminalen Prionproteindomäne läßt eine Anwendung in Kombination

mit Proteinase K-Verdau in Analogie zu den derzeit benutzten BSE-Testverfahren

nicht zu.

Im letzten Teil der Arbeit sollten RNA-Aptamere gegen einen für die Konversion

wichtigen Bereich des Prionproteins (AS 90-129) generiert werden. Es konnte

gezeigt werden, daß die in einer vorgeschalteten Prionpeptidselektion (AS 90-129)

identifizierten Aptamere in der Lage sind, ihr Zielmolekül im Gesamtkontext des

Prionproteins zu erkennen. In funktionellen Studien in persistent Prion-infizierten

Neuroblastomzellen wurde eine statistisch signifikante und spezifische Reduktion der

Akkumulation von GHQRYR synthetisiertem PrPSc zu hochmolekularen Aggregaten in

Gegenwart einer ausgewählten Aptamersequenz beobachtet. Im Verlauf der

Pathogenese von spongiformen Enzephalopathien korreliert die PrPSc-

Aggregatbildung mit Infektiosität und Neurodegeneration. Damit bieten die

selektierten Aptamere möglicherweise eine Ausgangsbasis um Therapeutika zu

entwickeln, die den Verlauf der Prionerkrankungen beeinflussen.

Weitere Episoden von „Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06“

• Photoelektronenspektroskopische Untersuchungen an Mischoxidkatalysatoren 16. Juli 2001
• cAMP als zentraler Botenstoff der hyperosmotischen Stressantwort in Dictyostelium discoideum 6. Juli 2001
• Reaktivität silylierter und stannylierter π-Systeme 27. Juni 2001
• Herstellung von Epstein-Barr Virus Glykoproteinmutanten zur Veränderung des Wirtsspektrums 25. Juni 2001
• Qualitätskontrolle von Proteinen in Mitochondrien 19. Juni 2001
• Phosphor(V)-nitride durch Hochdruck-Hochtemperatur-Synthese 18. Juni 2001
• Darstellung und Reaktionen chiraler Dialkylzinkverbindungen 6. Juni 2001
• Halogen-, Azid- und Koordinationsverbindungen des Arsens und Antimons 6. Juni 2001
• Oligomere und hochenergetische Borazide sowie elektrophile N+−F-Fluorierungsmittel 6. Juni 2001
• Funktionelle Charakterisierung der Signaltransduktionskaskade des LFA-1-Integrins 30. Mai 2001
• Substituierte Erdalkalimetall-bis(pentolide) und –bis(trialkylzinkate) 29. Mai 2001
• Halogen-, Azid- und Koordinationsverbindungen des Phosphors 22. Mai 2001
• Synthese und Charakterisierung von Gold-Azid- und Blei-Halogen-Verbindungen sowie Untersuchungen zur Schlagempfindlichkeit mittels der Fallhammermethode 22. Mai 2001
• Metallierung, oxidative C-C-Kupplung und C-N-Aktivierung mit Zinkorganyl-Verbindungen 7. Mai 2001
• Entwicklung einer High-Throughput-Sequenzierungsmethode für die Proteomanalytik 7. Mai 2001

Alle Episoden von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 · Mehr Bildung-Podcasts