Regulation antigeninduzierter T-Zell Aktivierung durch Integration stimulierender und inhibitorischer Signale

Episode von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 von Ludwig-Maximilians-Universität München · 7. Februar 2001

Die Aktivierung naiver Lymphozyten bezeichnet einen komplexen, immunmodulatorischen

Prozeß, in dessen Verlauf mitotisch inaktive B- und T-Zellen als Folge des Kontakts

mit Antigen in den Zellzyklus eintreten, proliferieren und anschließend zu spezifischen

Effektorzellen oder zu langlebigen Gedächtniszellen differenzieren. Die klonale Expansion

von Lymphozyten ist somit einerseits bedeutsam für die Förderung der akuten Immunantwort,

andererseits ist sie auch Voraussetzung für die Etablierung von dauerhafter, adaptiver

Immunität, deren zelluläre Grundlage die lymphozytären Gedächtniszellen darstellen. Auf

wiederholte Antigen-Exposition reagieren Lymphozyten mit unmittelbarer und effizienter

Aktivierung der Effektorfunktionen, beispielsweise der Produktion von Antikörpern durch BZellen

oder der zytotoxischen bzw. immunmodulatorischen Aktivität von T-Zellen.

Die Spezifität der Antigen-Erkennung wird in Lymphozyten durch hypervariable Antigenrezeptoren

gewährleistet, deren Stimulation ein komplexes Netzwerk von Signaltransduktionsprozessen

im Zellinneren initiiert. In T-Lymphozyten des Helfertyps resultieren diese

Signalkaskaden unter anderem in der transkriptionellen Induktion des IL-2 Promotors. Das

Signal des Antigenrezeptors wird jedoch moduliert durch die Aktivität von Corezeptoren, im

Falle von T-Helferzellen beispielsweise unter Beteiligung des CD4-Moleküls. CD4 bindet an

konstante Bereiche der antigenpräsentierenden MHC-II-Moleküle und stabilisiert so deren

Interaktion mit dem T-Zell-Antigenrezeptor (TCR). Detaillierte Untersuchungen zu den

Mechanismen der Koordination und Integration von Signalen des T-Zell-Antigenrezeptors mit

denen des CD4-Moleküls bildeten das übergeordnete Thema der vorliegenden Arbeit.

Sowohl der T-Zell-Antigenrezeptor als auch CD4 gehören zu einer Klasse von

Rezeptoren, deren zytoplasmatische Anteile an Proteintyrosinkinasen (PTKs) koppeln. CD4

interagiert konstitutiv und nahezu stöchiometrisch mit der src-ähnlichen Kinase p56lck, welche

während der Induktion von T-Zell Aktivierung eng mit der TCR-assoziierten Syk-ähnlichen

Kinase ZAP-70 zu kooperieren vermag. Die Verknüpfung beider Kinasen mit den nachgeschalteten

Signaltransduktionskaskaden erfolgt durch die Phosphorylierung spezifischer

Substrate, welche zu Beginn dieser Untersuchungen noch größtenteils unbekannt waren. Zwei

unabhängige experimentelle Ansätze sollten eine Identifikation potentieller in vivo Substrate

der Tyrosinkinase ZAP-70 ermöglichen. Aufgrund von Befunden mit transmembran

exprimierten Kinase-Fusionsproteine konnten mehrere Phosphoproteine als wahrscheinliche

Substrate von ZAP-70 bestätigt werden, die zur selben Zeit von anderen Autoren als solche

diskutiert wurden. Die zweite, parallel verfolgte experimentelle Strategie zielte auf die

Charakterisierung einer konstitutiv-aktiven Variante von ZAP-70, deren Expression in TZellen

zu einer Entkopplung von stimulierenden Signalen und somit zur Phosphorylierung

spezifisch nachgeschalteter Substrate führen sollte. Tatsächlich konnte - durch Substitution

carboxyterminaler Tyrosinreste von ZAP-70 - eine funktionell konstitutiv-aktive Mutante

generiert und deren Substrate in vivo analysiert werden. Dieser Ansatz resultierte in der

Charakterisierung einer bislang unvermuteten, positiv-regulatorischen Rückkopplungsschleife zwischen ZAP-70 und der ζ-Untereinheit des T-Zell-Antigenrezeptors. Dieser Rückkopplungsmechanismus

könnte bedeutsam sein für die Amplifikation von Signalen des T–

Zell Rezeptors. Dem Carboxyterminus von ZAP-70 würde somit entscheidendes Potential zur

Modulation von T-Zell Aktivierung zukommen.

Ein zweiter Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Charakterisierung des

bislang unbekannten Proteins ACP33, welches im Vorfeld als ein potentieller Interaktionspartner

der zytoplasmatischen Domäne von CD4 identifiziert worden war. Verschiedene

Befunde hatten zuvor darauf schließen lassen, daß - neben p56lck - alternative intrazelluläre

Liganden von CD4 existieren könnten. Mittels der Two-Hybrid Methodik konnte daraufhin

die cDNA des ACP33 Proteins kloniert und zudem dessen Bindungsspezifität analysiert

werden. ACP33 besitzt offenbar eine peptidbindende Domäne, welche spezifisch eine

Kombination zweier hydrophober, nicht-aromatischer Aminosäurereste am Carboxyterminus

von Peptiden erkennt. In der zytoplasmatischen Domäne von humanem CD4 und der aller

bekannter CD4-Orthologe ist ein derartiges Interaktionsmotiv konserviert. Copräzipitationsexperimente

und Mutationsanalysen bestätigten, daß C-terminale Deletionen von CD4 einen

Verlust der Interaktion mit ACP33 zur Folge haben. Derselbe Effekt resultierte überraschenderweise

auch aus der Substitution des Serinrestes 109 in ACP33, wodurch eine zu

Hydrolasen homologe Region des ACP33 Proteins als neuartige peptidbindende Domäne

identifiziert werden konnte. Funktionelle Analysen der carboxyterminalen CD4-Deletionsmutanten

identifizierte das Interaktionsmotiv mit ACP33 als eine inhibitorische Determinante

der antigenabhängigen T-Zell Aktivierung. ACP33 könnte demnach als eine negativ-regulatorische

Komponente des Signalnetzwerkes einen bedeutenden Beitrag zur Modulation von TZell

Aktivierung leisten.

Zusammengenommen verdeutlichen die Resultate beider Teilprojekte, daß Regulation von

T-Zell Aktivierung als ein integrativer Prozeß aus stimulatorischen und inhibitorischen

Signalen anzusehen ist. Detailliertere Analysen zur Koordination dieser gegensätzlichen

Signale sollte in Zukunft wesentlich zu einem besseren Verständnis von T-Zell Aktivierungsprozessen

beitragen.

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