Entwicklung einer High-Throughput-Sequenzierungsmethode für die Proteomanalytik

Episode von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 von Ludwig-Maximilians-Universität München · 7. Mai 2001

Ziel dieser Arbeit sollte die Entwicklung einer automatisierten, hochparallelen und nachweis-starken

Sequenzierungsmethode für Proteine im Rahmen der Proteomanalytik sein. Zur Kon-zeption

der Methodik sollte dabei mit der sogenannten Leitersequenzierung eine Kopplung

aus enzymatischem Aminosäureabbau und MALDI-Massenspektrometrie zum Einsatz kom-men.

Die experimentellen Grundparameter für die Leitersequenzierung im Bezug auf die

nasschemischen Sequenzierungsschritte und die massenspektrometrischen Messung wurden

dabei im ersten Teil der Arbeit zunächst manuell ausgearbeitet. Im zweiten Abschnitt wurden

dann die Möglichkeiten einer Automatisierung der so erarbeiteten Methode zur Leitersequen-zierung

auf verschiedenen Ebenen evaluiert.

Da der enzymatische Abbau eines Gesamtproteins durch dessen intrinsische Eigenschaften

wie Sekundärstruktur, Tertiärstruktur (Zugänglichkeit der Proteintermini für die Exopepti-dase)

oder Lösungsverhalten erschwert ist, wurden die Sequenzierungsprotokolle der Leiter-sequenzierung

für proteolytisch erzeugte, RP-HPLC-gereinigte Spaltfragmente von Proteinen

optimiert. Zudem besitzt die MALDI-MS, wie auch andere gängige massenspektrometrische

Verfahren, im Massenbereich über ca. 5-10 kDa eine zu geringe Auflösung und Genauigkeit,

um eine eindeutige Zuordnung der Massendifferenzen in den Leiterpeptidspektren zu den

durch Exopeptidase abgespaltenen Aminosäure zu erlauben. Bei Versuchen mit verschiede-nen

Endopeptidasen stellte sich – entgegen theoretischen Erwartungen – heraus, dass vor

allem auch Proteinspaltungen mit Endoproteinase GluC (im Phosphatpuffer) und

Chymotrypsin, neben Spaltungen mit Endoproteinase LysC, gute Voraussetzungen für die

nachfolgende enzymatische Sequenzierung liefern. Mit den Proteinfragmenten aus

Spaltungen der Endoproteinasen GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin wurden bei

den enzymatischen Sequenzierungen die höchsten Sequenzabdeckungen erzielt.

In der technischen Ausführung wurden alle Experimente im Hinblick auf eine Sequenzierung

direkt auf dem Target (on-target) optimiert. Geringfügige Anpassungen der erarbeiteten

Methoden erlaubten jedoch auch eine Sequenzierung von Peptiden, die zuvor auf PVDF-Membran

(Immobilon PSQ) aufgetragen wurden. Ein relativ kontrollierter und reproduzierba-rer

Abbau war in einem Temperaturbereich von ca. 25-35°C möglich. Die enzymatischen

Sequenzierungen erfolgten ausschließlich mit kommerziell erhältlichen Exopeptidasepräpara-tionen.

Eine zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Enzyme erwies sich als nicht notwen-dig.

Um eine einfache Interpretation der massenspektrometrischen Resultate zu gewährleisten,

wurden nur Monopeptidylpeptidasen eingesetzt. Für C-terminale Sequenzierungen wurden

mit CPY, CPP, CPW, CPA und CPB Carboxypeptidasen unterschiedlicher Spezifität einzeln

und in verschiedenen Kombinationen untersucht. Von der N-terminal Seite aus wurden Sequenzierungen mit APM, LAP, API und AAP durchgeführt. Eine Betrachtung der Sequen-zierungen

zeigt dabei, dass zumeist nur aus kombinierten Resultaten der Anwendung

verschiedener Carboxy- beziehungsweise Aminopeptidasen eine ausreichende Sequenzinfor-mation

erhalten werden kann.

C-terminal ist der Anteil sequenzliefernder Fragmente bei der Verwendung von CPY, sowie

bei den sequenziellen Peptidasenkombinationen sb(CP-I) und den Peptidasenmischungen

pb(CP) mit maximal 42% am höchsten. Hier treten auch vermehrt längere Teilsequenzen mit

bis zu 12 AS auf. N-terminal hebt sich APM als Einzelpeptidase mit überdurchschnittlich

guten Sequenzresultaten gegenüber den anderen Aminopeptidasen ab. Bis zu 34% der getes-teten

Peptide liefern allein schon mit diesem Enzym eine Sequenzinformation. Zudem wurden

längere Teilsequenzen mit bis zu 9 AS im Vergleich zu anderen Aminopeptidasen häufiger

erhalten. Sequenzierungen mit Aminopeptidasenmischungen bei N-terminaler Sequenzierung

brachten im Gegensatz zu Carboxypeptidasenmischungen bei C-terminaler Sequenzierung

kaum deutliche Vorteile. Auch sehr lange Sequenzabschnitte mit bis zu 16 AS N-terminal und

bis zu 25 AS C-terminal wurden in Einzelfällen erhalten. C- und N-terminal am häufigsten

wurden jedoch aus den Leiterspektren Teilsequenzen mit bis zu 6 AS erhalten (85% aller

sequenzliefernden Proteinfragmente). Der größte Teil der Sequenzabdeckung stammt mit

70% aus Teilsequenzen mit 3-9 AS.

Unter dem Hauptaspekt einer möglichen Steigerung der Sequenzinformation bei den Leiter-sequenzierung

wurden unterschiedliche Peptidderivatisierungen untersucht. Die gezielte N-terminale

Modifizierungen brachte in vielen Fällen durch die resultierende Massenverschie-bung

des derivatisierten Peptids einen Gewinn an C-terminaler Sequenzinformation. Gegen-über

entsprechend nicht-modifizierten Peptiden konnten durch die Massenverschiebung auch

Leiterpeptide beobachtet werden, die sonst mit Signalen der MALDI-Matrix interferieren. Bei

Modifikationsreagenzien, die eine fixierte positive Ladung oder ein ausgedehntes, delokali-siertes

Elektronensystem ins Peptid einbrachten, wie z.B. Sulforhodamin B oder FMOC-NHS

wurde dabei zusätzlich auch eine sehr gute Response im Massenspektrum beobachtet. Die

Empfindlichkeiten lagen selbst bei der Sequenzierung der Rohprodukte solcher Derivate im

unteren fmol-Bereich. Das charakteristische Isotopenmuster Brom-haltiger Peptidderivate

erlaubte weiterhin ein stark vereinfachtes Auslesen der Leitersequenz aus dem Massenspekt-rum.

Während die Leitersequenzierung allgemein keine Unterscheidung der isobaren

Aminosäuren Leucin und Isoleucin erlaubt, gelang die Unterscheidung der ebenfalls isobaren

Aminosäuren Lysin und Glutamin nach einer schnellen und selektiven Acetylierung des

Lysins mit anschließender C-terminaler Sequenzierung.Im Hinblick auf die Analyse post-translationaler Modifikationen wurden insbesondere

Phosphorylierungen eingehender untersucht. Dabei war sowohl bei der N-terminalen, als auch

bei der C-terminalen Leitersequenzierung ein enzymatischer Abbau der phosphorylierten

Aminosäuren zu beobachten und damit die entsprechende Phosphorylierungsstelle schnell

und eindeutig zu identifizieren. Die N-terminale Sequenzierung mit APM lieferte die besten

Resultate und ermöglichte sowohl den Abbau von Phosphotyrosin wie auch Phosphoserin,

während der C-terminale Abbau sich auf Phosphotyrosin beschränkt zeigte.

Aus der Summe der erhaltenen Resultate (Sequenzen) folgt, dass die Leitersequenzierung

unter den gegebenen Voraussetzungen – insbesondere der limitierenden Verfügbarkeit

zusätzlicher Exopeptidasen mit ergänzenden Spaltungsspezifitäten – im wesentlichen als

Instrument zur schnellen Generierung kurzer Sequenztags geeignet ist. Auf diesem Gebiet

stellt die erarbeitete Leitersequenzierung im Vergleich zur Edman-Sequenzierung eine

wesentlich schnellere Alternative dar. Im Gegensatz zu rein massenspektrometrischen

Sequenzierungen ist die Interpretation der Sequenzen im Massenspektrum stark vereinfacht

und daher zumeist eindeutig. Die Empfindlichkeit der Methode ist stark von der untersuchten

Peptidsequenz abhängig. Generelle Werte für die Empfindlichkeit lassen sich somit nicht

angeben, die Resultate lassen jedoch für eine Peptidausgangsmenge im oberen fmol-Bereich

(1000-500fmol) eine Leitersequenzierung ausnahmslos möglich erscheinen. Die Ergebnisse

von Verdünnungsreihen zeigen zudem, dass auch nach Sequenzierung von Peptidmengen im

mittleren bis unteren fmol-Bereich (50-10fmol) ein Auslesen der Peptidsequenz aus dem

Massenspektrum zumeist möglich ist. Zum Erreichen solcher Empfindlichkeiten ist die weit-gehende

Minimierung von Suppressionseffekten und damit die Verwendung von DHB als

MALDI-Matrix eine notwendige Voraussetzung.

Eine Evaluierungsstudie mit vier verschiedenen Proteinen führt zum Schluss, dass die Metho-dik

auch für die de novo Sequenzierung unbekannter Proteine ein hohes Potential birgt. Die

ermittelte Sequenzabdeckung der überlappenden Spaltfragmente lag bei maximal 80%. Im

Bereich prolinhaltiger Sequenzabschnitte fehlen Überlappungen dabei am häufigsten, da auf

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