Charakterisierung des negativen Cofaktors 2 der RNA-Polymerase II in vivo und in vitro

Episode von Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 von Ludwig-Maximilians-Universität München · 5. Dezember 2000

Biochemische Untersuchungen beschreiben NC2 als einen Transkriptionsrepressor,

welcher stabil an das TATA-Box bindende Protein (TBP) bindet. Die spezifische Bindung

von NC2 an TBP inhibiert die weitere Anlagerung der generellen Transkriptionsfaktoren

TFIIA und TFIIB und führt dadurch zur Unterbrechung der Bildung des Initiationskomplexes.

NC2 besteht aus zwei Untereinheiten, NC2a und NC2b, die starke Homologien zu den

Histonen H2A bzw. H2B aufweisen.

Alle Erkenntnisse zu Beginn dieser Arbeit basierten auf Beobachtungen, die in vitro

erhalten wurden. Unklar sind die Funktionen von NC2 in der Zelle. Die Aufgabe dieser Arbeit

bestand darin, ein in vivo-Modellsystem zu etablieren. Als Modellorganismus wurde die

Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt. Hefe hat zwei Proteine, die stark homolog

zum menschlichen NC2 sind. Beide sind essentiell für das vegetative Wachstum von Hefe.

Für Plasmid-Austausch-Experimente wurden Hefestämme konstruiert, bei denen die

chromosomalen Gene für NC2a und NC2b durch Wildtyp-Kopien auf einem URA3-Plasmid

ersetzt wurden. Mit Hilfe einer negativen Selektion gegen das URA3-Gen in Anwesenheit von

5-FOA gelang es, die humanen NC2a- und NC2b-Gene als episomale Kopien in Hefe stabil

einzubringen. So zeigte sich unter anderem, daß die beiden humanen NC2-Untereinheiten,

sowohl einzeln in Kombination mit ihrem Dimerisierungspartner aus Hefe als auch

gemeinsam in Form des menschlichen binären Komplexes, fähig waren, die physiologische

Funktion ihres Gegenstückes aus Hefe zu übernehmen. Das gleiche System wurde auch

eingesetzt, um Deletionsmutanten der humanen NC2-Gene in vivo zu untersuchen. Es wurde

festgestellt, daß in beiden NC2-Untereinheiten die Domänen, welche für die in vivo-Funktion

notwendig sind, die vom Mensch zur Hefe konservierten Regionen enthalten.

Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit bestand darin, spontane Suppressoren einer

limitierenden NC2-Funktion in vivo zu isolieren und Suppressoren mit genomischen

Punktmutationen zu charakterisieren. Gefunden wurde eine Punktmutation in der großen

Untereinheit (Toa1) des Hefe-TFIIA, welche einen einzigen Aminosäure-Austausch von

Valin zu Phenylalanin verursacht. Hefezellen, die diese Suppressor-Mutation in Toa1 (mt-

Toa1) tragen, weisen einen Kälte-sensitiven Phänotyp auf und sind trotz fehlender NC2-Gene

lebensfähig.

Die biochemischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins der Suppressor-Mutante

wurden durch Gelretardations-, Footprinting- und in vitro Transkriptionsexperimente

untersucht. Das Protein mt-Toa1 war in der Lage, stabile TFIIA-Komplexe zusammen mit der

kleinen Untereinheit Toa2 auszubilden und die Rekrutierung von TBP an die TATA-Box auf

dem Promotor zu unterstützen. Allerdings zeigten weitere Untersuchungen der Suppressor-Mutante, daß der ternäre Komplex aus mt-yTFIIA, TBP und DNA weniger stabil ist.

Hinweise darauf gab die reduzierte Menge an Protein-DNA-Komplexen im Fall von mtyTFIIA

in Gelretardationsexperimenten unter sättigenden Bedingungen. Das mt-yTFIIA

verlor zugleich seine Antirepressionsaktivität in in vivo-Transkriptionsexperimenten in

Anwesenheit von NC2. Die Isolierung und Charakterisierung der Suppressor-Mutante von

NC2 lieferten zum ersten Mal den Beweis, daß die Genregulation in vivo eine präzise Balance

zwischen positiv und negativ wirkenden Aktivitäten erfordert. Gleichzeitig bestätigen sie die

in vitro Beobachtungen, insbesondere das Gleichgewicht zwischen TFIIA und NC2 in der

Kompetition um das TATA-bindende Protein TBP.

Eine weitere Aufgabe der Arbeit waren Mutagenese-Studien von humanem NC2 in vivo

und in vitro. Innerhalb des Histone-Fold-Motives beider NC2-Untereinheiten wurden

Punktmutanten isoliert, die ihre essentielle Funktion in der Hefezelle vollständig verloren

haben. Es konnten Mutanten identifiziert werden, die Einfluß auf das Wachstum der Hefe mit

dem Verlust der in vitro-Aktivität korrelierten. Die Charakterisierung dieser Mutanten lieferte

erste Hinweise auf funktionelle Oberflächen von NC2, die für die ternäre Komplexbildung

(NC2-TBP-DNA) und die Repressionsfunktion wichtig sind.

Zusammengefaßt schafft die vorliegende Arbeit einen Einblick in die NC2-Funktion in der

Zelle und erweitert unser Verständnis über den molekularen Mechanismus der

Transkriptionsregulation während der Initiation der Klasse II-Transkription.

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